眼見為實(shí)，對于許多生物學(xué)家來說，他們想要看到的是通過顯微鏡觀察熒光標(biāo)簽。熒光顯微鏡使得在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上可視化熒光蛋白或染料成為可能，已成為現(xiàn)代生物學(xué)的主力。

1852年，英國科學(xué)家喬治&midDOt;斯托克斯爵士**描述了熒光的概念，其中一個分子吸收一個波長的光，然后發(fā)出更長波長的光。但這種技術(shù)是以高分辨率設(shè)想這一過程并使用它的技術(shù)。自20世紀(jì)10年代德國物理學(xué)家設(shè)計(jì)早期熒光顯微鏡以來，為了照亮細(xì)胞過程已經(jīng)走過了漫長的道路。科學(xué)家們在20世紀(jì)30年代開始使用熒光染料對組織進(jìn)行染色，并于1942年開始使用熒光標(biāo)記的抗體。1961年發(fā)現(xiàn)的水母綠色熒光蛋白有助于推動該領(lǐng)域的發(fā)展，因?yàn)樗箍茖W(xué)家能夠標(biāo)記各種有熒光的蛋白質(zhì)。 

在過去的幾十年中，科學(xué)家已經(jīng)開發(fā)了許多基于熒光顯微鏡的方法，不僅可以對分子的位置進(jìn)行成像，還可以對它們?nèi)绾我苿雍拖嗷プ?nbsp;

購買熒光顯微鏡時，科學(xué)家有很多選擇可供選擇，在決定之前需要考慮很多因素。本買方指南討論了儀器如何工作，它們可以用于什么以及在為您的研究需求選擇系統(tǒng)時應(yīng)該考慮什么。 

基礎(chǔ)

降低到**基本的水平，熒光顯微鏡檢查涉及照射具有某些波長的光譜的樣品，然后檢測發(fā)射的熒光團(tuán)。所以這一切都始于光源。訣竅是平衡入射或激發(fā)光的強(qiáng)度。

它越強(qiáng)，從樣品中獲得的熒光就越多，或者發(fā)出的熒光就越多。但強(qiáng)烈的激發(fā)光也會損壞樣品 - 甚**殺死活細(xì)胞或組織 - 或?qū)е缕渲械臒晒鈭F(tuán)“漂白”并隨著時間變得變暗。

落射熒光顯微鏡

顯微鏡學(xué)家有三個主要選擇：白色燈，LED或激光。弧光燈和LED照亮了所謂的落射熒光顯微鏡中的整個樣品。燈是**常見的光源，含有汽化汞和放電白光等氣體。然后，顯微鏡必須包括一個或多個濾光片，將光譜縮小到所需的波長 - 光譜的藍(lán)綠色部分，例如，激發(fā)樣品中的綠色熒光蛋白。這些顯微鏡一次將整個樣品浸泡在光線下，因此可以將它們光漂白。在使用顯微鏡之前，燈泡需要一些時間進(jìn)行預(yù)熱，它們通常可以持續(xù)使用幾百小時才會褪色并燒壞。當(dāng)它們褪色時，它們提供不同的強(qiáng)度，使得難以精確地比較甚**幾周之間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。

LED是另一種更新的選擇，越來越受歡迎。在這種情況下，每個LED在光譜的有限部分產(chǎn)生光，因此與使用白光時相比，需要的濾波更少。與弧光燈相比，LED需要更少的功率，持續(xù)數(shù)千小時而不會褪色，并且不需要時間來預(yù)熱或冷卻。他們還立刻將整個樣品洗凈; 然而，它們通常不像燈泡那么強(qiáng)烈，因此導(dǎo)致光漂白的可能性較小。它們比燈便宜，價格在幾美元左右。

來自光源的激發(fā)光從二向色鏡反射，以將其引向樣品。在那里它激發(fā)熒光團(tuán)，然后發(fā)射出自己的更長波長。然后通過物鏡收集該光，這放大了圖像并且對于確定分辨率和圖像質(zhì)量是**關(guān)重要的。給定的物鏡不僅具有給定的放大率（10倍，100倍等），而且還具有數(shù)值孔徑的數(shù)量。數(shù)值孔徑越高，所得圖像的分辨率和亮度越高。一些物鏡具有額外的透鏡以**小化圖像中的像差。

影響圖像的另一個因素是光線在通往該物鏡的途中經(jīng)過的介質(zhì)。 

如果光首先穿過空氣，然后撞擊物鏡的玻璃，一些光將在該邊界處散射，因?yàn)榭諝夂筒ＡЬ哂胁煌恼凵渎省＝虢橘|(zhì)（例如油）具有折射率以匹配物鏡并使光散射**小化。

樣品熒光團(tuán)發(fā)出的光比激發(fā)光暗得多，激發(fā)光也被樣品反射。這就是為什么將激發(fā)光反射到樣品上的二向色鏡是重要的。它允許發(fā)射光的波長在進(jìn)入顯微鏡的過程中通過，但阻擋強(qiáng)激發(fā)波長。發(fā)射的光還通過發(fā)射濾光器，其僅選擇所研究的熒光團(tuán)的輸出波長。這些激發(fā)和發(fā)射濾光片必須與您希望使用的任何熒光團(tuán)相匹配。

然后信號可以傳遞到目鏡，因此您可以查看樣品。但當(dāng)然，大多數(shù)科學(xué)家都希望記錄他們所看到的內(nèi)容。主要的相機(jī)選項(xiàng)是電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS）。兩者都是敏感的數(shù)碼相機(jī)，可將入射光轉(zhuǎn)換為電信號。EMCCD長期以來一直是標(biāo)準(zhǔn)，并且被認(rèn)為更敏感，特別是在低光條件下，但CMOS相機(jī)正在改進(jìn)。它們可以提供更快的圖像采集，更大的視野和更好的分辨率。

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共聚焦顯微鏡

如落射熒光顯微鏡那樣，用入射光擊中整個樣品意味著在所需視平面上方和下方的熒光團(tuán)發(fā)光，限制分辨率。為了消除這一挑戰(zhàn)，共聚焦顯微鏡  使用激光。使用鏡子，他們可以將光線聚焦在一個點(diǎn)上，因此樣品中其他地方的熒光團(tuán)不會被激發(fā)。在發(fā)射端，還有一個帶針孔的屏幕，用于將光從樣品限制到所需的焦點(diǎn)。

在激光掃描共聚焦顯微鏡中，機(jī)器掃描平面上的激發(fā)光點(diǎn)，并提供比落射熒光通常提供的更清晰的圖像。改變平面的水平導(dǎo)致在不同深度處的圖像的“堆疊”，從而給出了樣本的三維布置的概念。

激光掃描共聚焦顯微鏡只是共聚焦顯微鏡的一個版本。相比之下，旋轉(zhuǎn)磁盤和可編程陣列顯微鏡可以激發(fā)來自激光或落射熒光源的激發(fā)光 - 通過多個針孔掃描圖像。優(yōu)點(diǎn)是這些系統(tǒng)可以更快地獲得圖像，這對于活細(xì)胞中的成像活動可能是**關(guān)重要的。然而，激光掃描共聚焦顯微鏡通常提供**高分辨率。

查找，比較和評論
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像燈一樣，激光在成像前需要一些預(yù)熱時間，并且它們的強(qiáng)度**終會消失。但就像LED一樣，激光持續(xù)很長時間，也許是幾千小時。激光是**昂貴的光源，運(yùn)行數(shù)千美元。

為了檢測和放大弱發(fā)射光，共聚焦顯微鏡使用光電倍增管。入射光子首先擊中光敏光電陰極，它吸收光子并發(fā)射電子。然后該電子與一系列電極相互作用，每個電極發(fā)射的電子多于它吸收的電子。結(jié)果是信號的放大。

表：熒光顯微鏡

應(yīng)用

“現(xiàn)在幾乎每個人都在使用熒光，” 伊利諾伊大學(xué)厄巴納 - 香檳分校BECkman**科學(xué)與技術(shù)研究所的顯微鏡套件經(jīng)理斯科特羅賓遜說  。“你想做的事情真的很廣泛。”

“**重要的是蛋白質(zhì)定位，” 威斯康星大學(xué)麥迪遜分校Newcomb成像中心的植物學(xué)家兼主任Sarah Swanson說  。“你可以將你的GFP附加到你**喜歡的感興趣的蛋白質(zhì)上，看看它在活細(xì)胞中的位置。”或者，通過將GFP連接到感興趣的啟動子，可以觀察到表達(dá)水平如何隨時間變化。

與熒光團(tuán)連接的抗體也可以點(diǎn)亮感興趣的蛋白質(zhì)。同樣，熒光標(biāo)簽可以幫助科學(xué)家看到細(xì)胞和細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)的形狀。

雖然人們可以隨時固定組織并觀察它們，但活細(xì)胞成像也變得非常流行。研究人員可以隨著時間的推移跟蹤感興趣的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)，使他們能夠觀察到穩(wěn)態(tài)活動，或者看看當(dāng)他們用藥物或其他影響因素?cái)_亂系統(tǒng)時會發(fā)生什么。

對于長期的實(shí)時成像，在溫度控制和適當(dāng)水平的氧氣和二氧化碳的情況下，保持細(xì)胞在顯微鏡臺上舒適的腔室是**關(guān)重要的。

顯微鏡也已進(jìn)入高通量篩選應(yīng)用領(lǐng)域，使用自動顯微鏡可以在科學(xué)家參與其他地方的過程中觀察多個細(xì)胞。這使研究人員能夠檢查藥物庫或各種治療是否會影響蛋白質(zhì)的位置或活性并量化其結(jié)果。對于這些類型的實(shí)驗(yàn)，挑戰(zhàn)變成處理和分析所有圖像。

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共定位

因?yàn)楣庥羞@么多顏色，科學(xué)家可以看到同一樣品中的多種蛋白質(zhì)或染料，只要它們的激發(fā)和發(fā)射波長不同。這使得可以確定感興趣的蛋白質(zhì)或膜是否共同定位 - 表明它們居住在相同的空間中并且可以相互作用或不相互作用。

另一種觀察樣品中兩種標(biāo)記分子之間相互作用的方法是Förster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。當(dāng)兩個熒光團(tuán)彼此在納米范圍內(nèi)時，一個熒光團(tuán)的發(fā)射可以激發(fā)另一個熒光團(tuán)的熒光。“供體”熒光團(tuán)的發(fā)射波長必須與“受體??”的激發(fā)光譜重疊。因此，通過用顯微鏡光激發(fā)供體，人們應(yīng)該能夠觀察受體的發(fā)射。通過這種方式，科學(xué)家們可以確定兩個分子，甚**是同一蛋白質(zhì)的兩個部分，彼此靠近。

研究離子

蒙特利爾麥吉爾大學(xué)的寄生蟲學(xué)家Petra Rohrbach表示，她的激光掃描共聚焦顯微鏡幾乎是她所有實(shí)驗(yàn)的組成部分。她對瘧疾寄生蟲如何處理藥物，將它們泵入寄生蟲的酸性消化液泡以及使用活細(xì)胞成像來觀察處理感興趣。例如，她添加了熒光染料，寄生蟲就像是一種有毒藥物一樣處理，她可以在顯微鏡下觀察處理過程。

她還使用染料來指示鈣的濃度，膜上的電位或pH值。例如，通過用熒光染料加載寄生蟲，熒光染料隨pH變化而變色，她可以監(jiān)測消化液泡的酸度。如果其pH值向中性蔓延，則消化酶將無法發(fā)揮作用。羅爾巴赫說，殺死這種寄生蟲可能部分是因?yàn)樗鼰o法消化其食物。

Swanson也在研究植物如何對壓力源做出反應(yīng)時使用離子敏感染料。例如，當(dāng)植物彎曲并且機(jī)械應(yīng)力時，鈣水平會飆升。使用能夠改變熒光，向下或不同顏色的染料 - 當(dāng)被鈣結(jié)合時，她可以觀察活植物組織中發(fā)生的情況。遺傳編碼的離子指示器可以執(zhí)行相同的功能。

激光技巧

某些共焦顯微鏡中的激光不僅僅是成像。研究人員還利用它們來評估他們所看到的分子是如何移動的。隨著光漂白后的熒光恢復(fù)（FRAP），科學(xué)家們利用了太強(qiáng)的光可以破壞熒光團(tuán)這一事實(shí)。他們在視野的一部分消滅熒光團(tuán)，然后觀察熒光何時返回。該區(qū)域的原始熒光團(tuán)消失了，因此返回的熒光必須與從其他地方遷移的新熒光團(tuán)有關(guān)。這使研究人員能夠觀察擴(kuò)散或主動販運(yùn)的動態(tài)。

其變體是FLIP，其代表光漂白中的熒光損失。FLIP幫助科學(xué)家確定樣品的哪些區(qū)域相互連接，并允許材料在它們之間擴(kuò)散。研究人員反復(fù)光漂白一個斑點(diǎn)，一旦它們進(jìn)入就會摧毀任何熒光團(tuán)。在與該斑點(diǎn)相互連接的地方，整體熒光逐漸減弱。通過這種方式，生物學(xué)家可以確定區(qū)域的邊界。

對于許多實(shí)驗(yàn)室來說，熒光成像是他們研究的生命線。“這是我們所做的一切，實(shí)際上，”  北卡羅來納大學(xué)教堂山分校的Amy Gladfelter說  。她研究細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜是如何組織的，并使用活細(xì)胞成像，F(xiàn)RAP和其他技術(shù)來了解蛋白質(zhì)和細(xì)胞器如何排列和移動。她還使用先進(jìn)的技術(shù)，專注于蛋白質(zhì)在整個細(xì)胞中以及在細(xì)胞或體外的單個分子中移動的速度。

購物點(diǎn)

在試用潛在購買時需要檢查很多東西。一個問題是易用性。顯微鏡可以并且確實(shí)帶有許多鈴聲和口哨聲，但當(dāng)然這些功能僅在您需要它們的功能時才有用。那些有相當(dāng)基本需求的人可能更喜歡細(xì)胞成像系統(tǒng)。這些簡化的顯微鏡比傳統(tǒng)的全功能顯微鏡小，易于使用，具有觸摸屏界面。有些包括遮光罩，因此您無需在暗室中對細(xì)胞進(jìn)行成像。這些對于與學(xué)生一起工作特別有利，他們不會被設(shè)備嚇倒，并且可以專注于圖像。

顯微鏡簡單或花哨，科學(xué)家應(yīng)該考慮他們需要什么樣的成像模式。

除了多種顏色的熒光之外，研究人員通常希望通過相位對比成像來觀察具有透射白光的細(xì)胞。羅爾巴赫說，確切地知道細(xì)胞的邊界在哪里，這總是有用的。您可以使用的顏色數(shù)量 - 例如，顯微鏡可以與之連接的激光線數(shù)量 - 對于那些使用許多不同熒光團(tuán)的人來說也是一個重要因素。

分辨率是一個需要考慮的關(guān)鍵特性，因?yàn)樗鼪Q定了您能夠區(qū)分哪些類型的特征。由顯微鏡和使用中的物鏡決定的視場也很重要。例如，觀察神經(jīng)元的科學(xué)家可能需要足夠大的視野來觀察所有樹突和軸突到達(dá)的位置，但研究細(xì)菌的研究人員可能會對較小的視野感到滿意。Robinson補(bǔ)充道，另一種可能性是，某些顯微鏡軟件可以自動將多個圖像拼接在一起，從而創(chuàng)建來自幾個小視野的大視圖。

買家需要做的另一個選擇是使用直立顯微鏡 - 其中物鏡朝下放置在舞臺上的樣品 - 或倒置顯微鏡，其中物鏡朝上。倒置系統(tǒng)通常用于研究培養(yǎng)細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞**寬的部分是接觸培養(yǎng)皿表面。羅賓遜說，當(dāng)然，如果樣本很大 - 例如用于活體顯微鏡檢查的動物 - 只有直立的樣本。

您還需要決定是否要讓目鏡透過，或者只是想要樣品的數(shù)字圖像。Rohrbach指出，有些顯微鏡缺少目鏡。

如果您無法立即負(fù)擔(dān)所需的所有功能，請尋找可在實(shí)驗(yàn)室中更新的顯微鏡 - 例如，通過添加用于活細(xì)胞成像的培養(yǎng)箱--Robinson建議。同時，尋找在您所在地區(qū)擁有技術(shù)支持的公司，以便您在需要時快速獲得幫助。

概要

雖然光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ) - 光子進(jìn)入樣品并在光學(xué)引導(dǎo)下返回 - 已有數(shù)百年歷史，但熒光顯微鏡仍在不斷發(fā)展。科學(xué)家和工程師正在開發(fā)更加靈活的方法來改進(jìn)靈敏度和分辨率等功能。例如，超分辨率技術(shù)的出現(xiàn)意味著科學(xué)家們現(xiàn)在可以在不到200納米的范圍內(nèi)區(qū)分細(xì)胞特征。

即使制造商使用**新的花哨更新他們的產(chǎn)品，他們也正在創(chuàng)建簡化，價格合理的產(chǎn)品，幫助實(shí)驗(yàn)室訪問熒光顯微鏡。那些只想觀察一兩種蛋白質(zhì)的人可能能夠使用方便的細(xì)胞成像系統(tǒng)。對于那些考慮更**應(yīng)用的人 - 例如活細(xì)胞成像，F(xiàn)RAP或FRET顯微鏡（如共聚焦系統(tǒng)）提供了更多選擇。

科學(xué)家在購買顯微鏡時有很多選擇。問自己的關(guān)鍵問題是：“我將使用它來做什么？”這應(yīng)該讓您清楚地了解所需的功能。

編者注：我們要感謝并感謝Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室全球產(chǎn)品經(jīng)理VeronIKA Kortisova-Descamps女士對本文的深刻討論和貢獻(xiàn)。