在顯微鏡中，一個(gè)重要的持續(xù)目標(biāo)是希望更清楚地看到較小的東西。由于光的衍射極限，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡面臨大約200-250納米的分辨率極限。為了觀察樣品的較小特征，科學(xué)家們可以應(yīng)用超分辨率顯微鏡，它可以顯示尺寸僅為幾十微米的細(xì)節(jié)。這些用于成像樣品的新技術(shù)提供的分辨率曾經(jīng)看起來太好了，不能真正打破看似牢不可破的障礙。科學(xué)家必須考慮這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)，然后找到**適合特定研究目標(biāo)的方法。

通常，超分辨率顯微鏡包括一些不同類型的技術(shù)，例如受激發(fā)射耗盡顯微鏡（STED）。另一種超分辨率方法是單分子定位顯微鏡，包括光活化定位顯微鏡（PALM）和隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）。一些科學(xué)家還將結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡（SIM）添加到超分辨率方法列表中，但其他人會(huì)說這種技術(shù)無法比共聚焦顯微鏡更好地成像。

本文將簡要介紹這些技術(shù)的工作原理。在STED顯微鏡中，激光在非常有限的區(qū)域或焦點(diǎn)上打開和關(guān)閉熒光標(biāo)記。然后，這些激光掃描樣品以產(chǎn)生圖像。在某些情況下，STED可以與活細(xì)胞成像相結(jié)合。對(duì)于PALM和STORM，熒光團(tuán)也不會(huì)同時(shí)被激活。以這種方式，熒光標(biāo)記以可用于構(gòu)建極高分辨率圖像的序列打開。然而，PALM和STORM都不是活細(xì)胞成像的理想選擇，但這些方法可以相對(duì)容易地轉(zhuǎn)變?yōu)槠脚_(tái)。SIM技術(shù)創(chuàng)建了在圖像上移動(dòng)的網(wǎng)格狀光圖案，然后傅立葉變換用于生成圖像。

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鑒于這項(xiàng)技術(shù)被稱為超級(jí)分辨率，它有多好？簡短的回答是：比普通光學(xué)顯微鏡更好。因此，這意味著超分辨率顯微鏡必須提供可以分辨小于200納米的細(xì)節(jié)的圖像。但是，有些方法比其他方法更好。SIM的分辨率約為100納米，約為普通光學(xué)顯微鏡的兩倍。對(duì)于STED，一些平臺(tái)提供30納米分辨率的活細(xì)胞，15個(gè)細(xì)胞固定。通過PALM或STORM，科學(xué)家們可以看到僅約15納米的細(xì)節(jié)。

更好的成像不僅僅是更好的分辨率。

正如已經(jīng)指出的那樣，更好的成像不僅僅是關(guān)于更好的分辨率。目標(biāo)是看到更小的東西，并能夠描述和解釋它們是什么。因此，超分辨率顯微鏡的信噪比也很重要。更高的信噪比可以創(chuàng)建更清晰的圖像，而這可能是**重要的。具體的比較取決于所使用的特定平臺(tái)，樣品和成像條件，但差異可能很大。例如，牛津大學(xué)**成像部門經(jīng)理Ian DObbie及其同事表示，  SIM在一次比較中產(chǎn)生的信噪比是STED的900多倍。對(duì)于科學(xué)家來說，知道什么是signal-t0-noISE是可能的，有時(shí)只需要比較幾種或更多種方法。

時(shí)間考慮因素也起作用。如果科學(xué)家需要了解某些東西是如何移動(dòng)的，那么**好的選擇就是它取決于它。如果事情很重要，SIM可以非常快速地跟蹤運(yùn)動(dòng)，但它不能提供足夠的分辨率來對(duì)分子進(jìn)行分析。STED可用于跟蹤，速度取決于圖像的大小，因?yàn)镾TED掃描它。PALM和STED也可以跟蹤動(dòng)態(tài)事件，但不是很快，因?yàn)檫@些方法將數(shù)千個(gè)圖像合并為一個(gè)。

除了基本技術(shù)，科學(xué)家們不斷擴(kuò)展超分辨率顯微鏡的功能，這里有幾個(gè)**近的例子。

修改方法

要真正了解生物系統(tǒng)如何工作，必須在上下文中查看組件，這可能需要三維（3D）成像。一些技術(shù)以高分辨率提供3D成像，但對(duì)樣本不是很深。因此，LaboratoirepHotoniqueNumériqueetNanosciences的研究員Pierre Bon和他的同事開發(fā)了一種名為SELFI的方法，他們將其描述為“多細(xì)胞標(biāo)本和組織中3D單分子定位的框架。”使用這種技術(shù)，科學(xué)家們成像肌動(dòng)蛋白絲在樣品表面下方低**50微米。在這項(xiàng)工作中，科學(xué)家們使用了球體 - 細(xì)胞的3D培養(yǎng)物 - 這些材料甚**不需要在這些深度進(jìn)行成像清除。

如上所述，在某些應(yīng)用中可能需要在空間和時(shí)間上進(jìn)行成像。這可以通過各種方式完成，并且新方法不斷涌現(xiàn)。**近，洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)光學(xué)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人Theo Lasser建立了一個(gè)結(jié)合3D超分辨率顯微鏡和3D相位成像的平臺(tái)，可用于繪制細(xì)胞甚**細(xì)胞器，科學(xué)家稱之為一臺(tái)4D顯微鏡。

科學(xué)家可以購買一個(gè)，而不是建立超分辨率系統(tǒng)。例如，尼康生產(chǎn)的N-SIM超分辨率顯微鏡可用于活細(xì)胞成像，每秒可拍攝15幀。來自奧林巴斯的科學(xué)家們可以購買IXplore SpinSR10超分辨率成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)專為活細(xì)胞成像而設(shè)計(jì)，可提供120納米的分辨率。尼康和奧林巴斯系統(tǒng)都可以在不同形式的成像之間切換。例如，奧林巴斯文獻(xiàn)指出IXplore SpinSR10可以“在超分辨率，共焦和寬場(chǎng)成像之間切換。”為了探索多個(gè)細(xì)節(jié)，科學(xué)家們可以從徠卡顯微系統(tǒng)中選擇HyVolution 2，它可以提供140納米的分辨率并成像多個(gè)熒光團(tuán)。超分辨率系統(tǒng)甚**不需要占用大量實(shí)驗(yàn)室空間。例如，GE Healthcare將其DeltaVision OMX SR描述為“專門為結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡（SIM）超分辨率技術(shù)提供穩(wěn)定平臺(tái)的緊湊型成像系統(tǒng)”，并且可用于多種模式進(jìn)行活細(xì)胞成像，包括動(dòng)態(tài)圖像捕獲。 這只是一小部分可用選項(xiàng)。

在進(jìn)入超分辨率顯微鏡之前，要做出的各種決策和需要考慮的技術(shù)需要科學(xué)家進(jìn)行一些研究，但對(duì)研究的影響可以使時(shí)間得到很好的投入。科學(xué)家在樣本中可以辨別的細(xì)節(jié)越多，我們就能越了解周圍的世界。